VİROLOJİ 1 DERS NOTLARI VİZE

VİROLOJİ

VİRÜS YAPI PRENSİPLERİ

Kapsidlerine göre ;

-          Kübik yapı : 20 eşkenar üçğenin birleşmesi ile oluşur.

-          Helikal yapı : Kapsomerler RNA’nın etrafını sarar bu yapıda olanlar RNA virüsüdür. Zarflı virüslerdir. Zarflı oldukları için çevre şartlarına oldukça duyarlıdırlar.

-          Kompleks yapı : Oval şekilde tuğla görünümleri vardır. Sadece poxviridae ( çiçek grubu)’nda görülür.

-          Binal yada kombine yapı : Sadece FAJ’larda gözlemlenir. Bakteri enfekte eden virüslerdir. Hem helikal hemde ikozoherdal yapıdadır.

Not : Kapsidler kapsomerlerden meydana gelmiştir.

VİRÜSLERDE REPLİKASYON VEYA ÇOĞALMA

Hücre içerisine girdikten sonra 3 temel basamakta oluşur.

1-      Replikasyona hazırlık

2-      Replikasyon ve virüs genom ekspresyonu

3-      Agregasyon ve olgun virüs partikülün dışa çıkması

REPLİKASYON SİKLUSU

1-      Adsorbsiyon ( Ataçman ) : Hücre yüzeyine resöptörlere bağlanma aşaması.

2-      Penetrasyon: Hücre içerisine girme aşaması

3-      Soyunma : Kapsidden ayrılma

4-      Genom replikasyonu ve ekspresyon

5-      Toparlanma

6-      Olgunlaşma

7-      Saçılım

A)     Adsorbsiyon : 1 den fazla reseptör bulunabilir ki buna bağlanma yaparlar.

-          Tuz konsantrasyonu

-          pH’’sı

-          Isısı tarafından direkt olarak etkilenir.

Bu şartlarda meydana gelecek değişiklikler bağlanmayı bozabileceği gibi uygun olmayan şartta tutunma meydana gelmez. Reseptör zarflılarda zarfta bulunurken zarfsız olanlarda ise kapsidde bulunur.

B)      Penetrasyon :Hücreye tutunduktan sonra hücre içerisine girer. 3 temel mekanizma vardır ki ;

-          Direkt: Zarfsızlarda ve Kapsidli virüslerde olur.

-          Füzyon : Zarflı virüsler tarafından oluşturulur.

-          Endositoz : Kese oluşur ve hücre zarı içeri çökerek virüs bir hücre zarı ile içeri girer , zardan kurtulup kapsiddende kurtularak enfekte eder.

C)      Kapsidden arınma : Endozomlar içinde meydana gelir. Düşük pH’ı ile kapsidden arınır. Bu döneme EKLIPS dönemidir.

D)     Genom Replikasyonu ve Gen Ekspresyonu : mRNA yazılımı olunca transkripsiyon başlar tamamlandıktan sonra erken ve geç dönem proteinlerinin translasyonu gerçekleşir.

-          Erken dönem proteinleri : Genom replikasyonundan sorumludurlar.

-          Geç dönem proteinleri : Virüslerin yapısal proteinleridir.

E)      Toparlanma : Nükleik asitler bir araya gelerek kapsidlenir ve bu durumda hala enfektif değildir.

F)      Olgunlaşma : Viral proteazlar işlemini yapar son dönem proteinleri ile birlikte enfekte edebilecek duruma gelir.

G)     Saçılım : Zarfsız virüsler enfekte ettiği hücrenin zarını patlatıp saçılır. Zarflılar hücre çeperinde kendine zar yaparak dışarı çıkarlar. Bazıları ise yine ekzositoz yolu ile dışarı çıkar.

VİRÜS ÇOĞALMASININ DURDURULMASI

Viral adsorbsiyonu etkileyenler ;

-          Sülfatlı polisakkaritler

-          Deterjanlar

-          Antikorlar

EKLIPS’lerde etkili olanlar ;

-          Antiherpetikler : Nükleotid veya Nükleotit’i sonlandırma özelliğine sahip olup DNA’nın uzamasını engeller.

-          Asidifikasyon

-          Transkripsiyonu engeller : Retro – virüsler’in tedavisinde kullanılır.

-          Hücreden çıkışı engelleyenler : Grip tedavisinde kullanılır.

Antiviralin kullanımındaki dezavantajlar :

1-      Tedavi etkisi sınırlıdır.

2-      Yüksek sitotoksite etkileri vardır.

3-      Dayanıklı virüslerin ve mutantların ortaya çıkmasını sağlar

4-      Lokal enfeksiyonlarda etkili oluşu

5-      Tek etken lezyonlarda uygulanabilirliği.

İNTERFERANS VE İNTERFERON :

İnterferans : Bir hücreye aktif veya inaktif bir virüs olduğunda 2. Bir virüsün hücreye girmesini engellemesi ve üremesini engelleme. Hücredeki bulunan virüse inferens virüs denir.Bağşıklıkla ilgisi yoktur.

İnterferon : 3 tipte bulunur ki bunlar alfa , beta , gama olarak isimlenirler.

-          Tip 1 : alfa, beta

-          Tip 2 : gama

Alfa : Lökositler tarafından salınır

Gama : T- Lenfositler ve NK hücrelerinden salınır

Beta : Fibroblastlar tarafından salınır ve protein sentezini inhibe eder.

İnterferon etkisi spesifik değildir.

İnterferon özellikleri :

1-      Virüslere karşı oluşan antikorlar ile nötralize edemezler.

2-      Adsorbsiyonu engelleme özelliğine sahiptir.

3-      RNA ve mRNa’yı parçalama veya sentezini durdurucu enzimler ortaya koyar.

4-      İnterferon yapımı geçicidir.

5-      Çok çabuk oluşurlar.

6-      Hücre dışı virüsler üzerine direkt etkisi yoktur.

7-      Antikordan önce viral hastalıklara erken dönemde etki eder.

Virüslerin Sınıflandırılması

Dizin: mononegoviroles       Aile: paramyxoviridae     Alt Aile: paramyxovirince   Genus: morbilivirus

Tür: Rinelerpest virus (sığır vebası virusu)

a) Virion özellikleri

-Virion büyüklüğü

-Virion şekli

-Zarf olup olmaması

-Kapsomer Simetri

b) Genom özellikleri

-Nükleik asit tipi (Dna-Rna)

-İplik sayısı (tek veya çift)

-Linear veya Sirküler

-Polaritesi (+,-)

-Segment sayısı

c) Proteinlerin özellikleri

-Proteinlerin sayısı

-Proteinlerin ölçüsü

-Fonksiyonel öz.

-Aa. Dizilimi

d) Replikatif özellikleri

-Replikasyon stratejisi

-transkripsiyon karakteristikleri

e) Fiziksel Özellikleri

-Ph stabilite

-Termal stabilite

-Katyonluk

-Solvent ve deterjan

f) Biyolojik özellikleri

-Serolojik ilişki

-Konak genişliği

-Doku Transpismi

-Bulaş yolu

-Vektör ilişkisi

-Coğrafi dağılım

NOT: Günümüzde en çok genom özelliklerine göre sınıflandırılır.

Bilinmesi Gerekenler

-DNA Taşıyan viruslar

*Adenoviridae

*Hepadnaviridae

*Herpesviridae

*Parvoviridae (kanlı ishal)

*Popoviridae

*Poxviridae

-RNA Taşıyan Viruslar

*Arenoviridae

*Bunyaviridae (BBD Virus)

*Coliciviridae

*Coronaviridae

*Flavaviridae

Subviral Enfeksiyöz Ajanlar

Viroid: Kapsid bulunmaz, sadece nükleikler bulunur. Tek iplikçikli sirküle olan RNA ya sahiptir.

Virusuot

Prion hastalıklar: Nükleik asit içermezler. Protein hastalığıdır.

Virusların Genetiği

-Virusların yapı ve patogenetik özelliklerinin ortaya çıkarılması

-Virusların orjinlerinin tespiti

-Saha suşları arasındaki farklılıkların ortaya çıkması

-Diagnostik (serotip düzeyinde identyficasion)

-Attenüasyon (virülens kaybı ve zayıflama)

 *Mutasyon, rekombinasyon

NOT

Vahşi tip virus: Sahadan aldığımız viruslardır. Sahadan alınan viral enfeksiyonu yumurtaya yada başka yerler enfekte ederek pasajlama yapıyoruz. Daha sonra mutasyona uğratıp viral özelliği kaybedip antijenik yapısı aşı yapımında kullanılıyor.

Laboratuvar tip virus: Laboratuar ortamında ki hayvan veya canlılardan elde ettiğimiz deney amaçlı viruslardır.

DNA polimeraz: Profreading DNA işlemesinde hataları ortadan kaldırmaya yarar RNAda bu özellik yoktur.

Mutasyon

Virus genomunda meydana gelen kalıcı değişikliklere denir. Mutasyonlar;

-Virusların doğada varolma yollarından en önemlisidir.

-RNA  virusların DNA viruslarına oranla daha çok meydana gelir.

Mutajenler

a)      Kimyasal mutajenler

-Baz analogları, DNA tabanını değiştirenajanlar, Alkilleyici ajanlar, asilleyici ajanlar, İnterkalasyon yapıcı ajanlar

b) Fiziksel mutajenler

-Isı ve ph , Işınlar

Viruslar arasındaki genetik ilişkiler

-İntermoleküler  rekombinasyon

-Genetik reassortment (çeşitlenme)

-Komplementasyon

-Transdüksiyon

Viral Patogenez

-Etkenin organizmaya giriş yolu

- İlk çoğalma yeri

-Organizma içinde yayılma şekli

-Patolojik değişikliklerin oluşumu ve klinik belirtiler

-Patojenite: Apatojen, Patojen

*Patojense Virulens artar,

İmmuntolerans: Organizmanın antikor salınımı yapmama durumudur.

İmmunkompletan: Virus girişine yanıt oluşursa, o organizmaya denir.

Koch Postulatı

-Bir hastalık tablosunun infeksiyon olabilmesi için;

*Etken her hastalık olayında mutlaka bulunmalıdır.

*Etken konaktan izole edilmeli ve in-vitro olarak üretilebilmelidir.

*Saf etken sağlıklı bireylere dışarıdan verildiğinde hastalık tekrar oluturabilmelidir.

*Deneysel infeksiyonlardan sonrada aynı etken bireylerden tekrar izole edilebilmelidir.

Herhangi bir infeksiyona maruz kalma dönemleri;

*Prenatal dönem, Perinatal dönem, Postnatal dönem

a) Prenatal Dönem İnfeksiyonları

1. Eşey hücreleri ile kopulasyon anında

–        Oosit (BVD virus)

–        Spermatozoon (IBR virus=BHV-1)

2. Hamilelikte maternal infeksiyonların embriyo veya fötusa ulaşması ile

–        Inutero (Uterus mukozası veya duvarlarındaki infeksiyonlar) à BHV-1

–        Transplasental (Maternal viremi sırasında plasenta aracılığı ile) à BTV, AKA, BVDV

b)Perinatal Dönem İnfeksiyonları

1. Maternal Bulaşma
1. İdrar ve dışkı ile (CMV, BRV)
2. Reaktive latent infeksiyonlar (Herpesvir.)
2. İatrogenic Bulaşma (İnfekte malzemelerin kullanımı sonucu)

c)Postnatal Dönem İnfeksiyonları

•          Direkt temas (RPV, CDV)

•          İnhalasyon (IBR, PI-3, Çiçek)

•          Oral (BRV, Enterovirus, BSE)

•          Venereal (Coital exantheme)

•          Sexual (HBV, HCV, HIV)

•          Transfusion (HBV, HCV, HIV)

•          Cutaneal (ORF)

•          Isırma (Kuduz, FeLV, FIV)

•          Hava (Air-borne) (Şap-FMD)

•          Vektör (BTV, AKAV, BEFV)

Postnatal İnfeksiyonların Seyri

•         Organizmaya giriş yeri à Primer replikasyon

•         Viremi à Ön çoğalmasını tamamlamış virusun affinite duyduğu (tropism) hücre grubuna ulaşmak için kanla taşındığı dönemdir. En belirgin belirtisi ateştir. Bazı hastalıklarda iki fazlı viremi dönemi olabilir (Çiçek).

•         Aktif Viremi à Viral replikasyon

              Pasif Viremià İnjeksiyon

Postnatal infeksiyonlar seyirlerine göre

 AKUT veya PERSISTE olabilirler;

•         AKUTà Etkenin organizmaya girişinden sonra hastalık tablosu gelişimi ve bağışık yanıt aracılı eleminasyon ile karakterize seyirdir.

•         PERSISTE à Etkenin organizmaya girişi ile hastalık belirtilerinin çıkışı arası sürenin uzun olduğu, progresif ve yavaş gelişen infeksiyon şeklidir.

Persiste İnfeksiyonlar

•          Kronik İnfeksiyonlar (Old Dog Encephalitis, Şap)

•          Yavaş (Slow) İnfeksiyonlar (Retroviral infeksiyonlar; EBL, CAE, MV, AIDS vb)

•          Latent (Gizli) İnfeksiyonlar (Tüm Herpesvirus inf.)

Persiste İnfeksiyonların Önemi:

1. Epidemiyolojik Önemleri vardır,
2. Reaktive olup, her an akut hastalık tablosu sergileyebilirler,
3. İmmun patolojik hastalıklardır,

Neoplasm’ların gelişimine neden olurlar.

Kronik İnfeksiyonlar

Gençlik hastalığının bir geç komplikasyonu olan Old Dog Encephalitis (Yaşlı Köpek Ensefaliti) en iyi örnektir.

Slow (yavaş) İnfeksiyonlar

Tüm retrovirus infeksiyonları (AIDS, CAE, MV, EBL, FAIDS vb) bu tip kalıcı infeksiyonlara en iyi örnektir.

Latent İnfeksiyonlar

Akut hastalık tablosunun zaman zaman tekrarlaması ile karakterizedir. Herpesvirus infeksiyonları buna en iyi örnektir. İlk oluşana primer infeksiyon tekrarlayanlara ise rekürrent infeksiyon adı verilir.

VİRÜSLER NEDEN ÜRETİLİR

. Virusları izole ve identifiye etmek için

. Viruslar arası ilişkinin ortaya konması için

. Profilolaktik ürünler elde etmek ve standardizasyonu yapmak için

. serolojik testlerde kullanmak için

.  hiperimmun veya tip spesifik serum elde etmek için.

. epidemiyolojik ve patogenetik özelliklerini ortaya koymak için.

. Viruslar sadece canlı sistemlerde üretilir , virusun ürediği bu sisteme konak adı verilir. Konak sistemler in vivo veya in vitro olarak 2 temel grupta incelenir.

İn vivo sistem : Deneme hayvanı , embriyolu tavuk yumurtası ( ETY ).

İn vitro sistem : Hücre kültürü

DENEME HAYVANLARI

1.       Konvansiyonel hayvanlar : Herhangi özel bakım ve besleme programı uygulanmayan hayvanlar , hiper immun serum eldesi

2.       Spesifik patogen free ( SPF ) : Üzerinde çalışılan patojen ve buna ait serolojik yanıttan yoksun hayvanlardır. Özel bakım ve besleme uygulanır. Sürekli olarak üzerinde çalışılan patojen yönünden virolojik ve serolojik olarak kontrol edilir. Profilaktik ürünlerin potens ve sterilite kontrolleri için kullanılırlar.

3.       Germ Free : Hiçbir patojen ve apotojen m.o taşımayan hayvanlardır. Kendileri gibi GF olan ebeveynlerden elde edilir. Yem ve ortam havaları steril edilmek suretiyle verilir. Sürekli olarak kan ve tüm vücut sekret ve ekskretleri tüm patojenler yönünden kontrol edilir. Özel patogenez çalışmalırında kullanılır.

DİKKAT!!!

1.       Virusa duyarlı hayvan türü

2.       Virusa duyarlı inokulasyon yolu

3.       Virus’un saflığı

4.       Virus’un titresi

5.       Kontrol gruplar göz önüne alınmalıdır.

İNOKULASYON YOLLARI

1.       İnokulasyon : Virus veya infektif materyalin yandaki yollardan herhangi birisi ile organizmaya verilmesidir.

2.       İnfeksiyon : Virus veya infektif bir materyalin duyarlı bireye verilmesi veya doğal olarak girmesi durumudur.

3.       Hastalık : Virus infeksiyonu sonrası oluşan patojenlere bağlı olarak yaşamsal fonksiyon ve davranışlarda ki normal dışı bulgular bütünüdür.

4.       Epruvasyon : Daha önceden immunite edilen bireylerin virulant virusla tekrar inokule edilmesidir.

POST İNOKULASYON İNFEKSİYON TAKİBİ

1.       Antemortem : Ateş , sekret ve ekskretlerden etken izolasyonu , antikor tayini, klinik hastalığın incelenmesi ;

-          Doğal ölüm

-          Sacrifice

2.       Postmortem : Makro ( otopsi ) ve mikropatoloji

GENEL KAVRAMLAR 1

1.       Yumurta seçimi : hastalıksız sürülerden döllü yumurtalar alınır. Beyaz renkli ve yaklaşık 50-60gr ağırlıkta olanlar arzulanır.

2.       İnkubasyon : özel inkübatörler ile ( kuluçka makinası ) saklanırlar. Bunlar 30-37 C ‘de ısı , %40-70 rölatif rutubete sahiptirler. İnkubasyon süresince hergün canlılık kontrolü yapılır.

-          Canlılık kontrölü karanlık bir sahada ve yüksek ışık kaynağı altında yapılır. Başlangıçta sadece yumurta sarısı üzerinde dar bir alanda tespit edilen damarlar hergün artar. Göz küresi ve ekstremiteler belirginleşir. Embriyo hareketlenir. Ölü olan embriyolar hareketsiz , soluk gri damarlar ve değişmeyen büyüklüktedir. Açılırsa çok pis kokar.

3.       İnokulasyon : Direct embriyoya ( iv , sc , retrobulbar vb. ) veya aksesuar yumurta kompanentlerine ( CAM ,CAB, AK , SK ) yapılabilir.

4.       İnbubasyon ve günlük kontröller : daha önce belirtildiği gibi yapılır. Virus üremesine bağlı olarak embriyo ölümü takip edilir. İlk 48 saat içinde ölümler uygulama hatası olarak kabul edilir.

5.       İnfeksiyonun takibi : Ölen veya öldürülen embriyoya ait sıvı ve doku örnekleri virus üremesi yönünden takip edilir.

-          CAM : Lokal damarlaşma , opasite , POX oluşumu

-          CAB : Sıvıdan Hemaglutinasyon yapar.

-          AK : Sıvıdan Hemaglutinasyon yapar.

-          SK : Sarı kesesi zarı boyanır ve inklüzyon cisimcikleri taranır.

CHORİALLONTOİK MEMBRAN ( CAM ) :

9-12 günlük embriyo pox – herpes virüs kullanılır. Pencere şeklinde açılan kabuktan girilir ve zara damla halinde virüs süspansiyonu bırakılır. Damla altına gelen yerler enjektör ucu ile çizilir.

CHORİALLONTOİK BOŞLUK ( CAB ) :

9-12 günlük embriyo newcastle virusu , virus üremesi allontois sıvısına yapılan HA testi ile tespit edilir.

AMNİON BOŞLUĞU ( AK )

9-12 günlük embriyo influenza virusu mumps ( gaba kulak ) virusu , virus üremesi amnion sıvısına yapılan HA testi ile tespit edilir.

SARI KESE ( SK )

6-8 günlük embriyo kuduz virusu , mavi dil , EHV-1 , EHV-4 , virus üremesi gerek yumurta sarısı gerekse sarı zarın özel boyalarla boyanarak inklüzyon cisimciklerini tespit edilmesi esnasına göre takip edilir.

GENEL TANIMLAR

1.       Organ kültürü : organların belirli bir bölümü veya tamamının fonksiyon ve yapıları muhafaza edilmek şartı ile in vitro olarak saptanmalıdır.

2.       Doku kültürü : dokuların fonksiyon ve yapıları bozulmaksızın in vitro olarak saklanmaları ve üretilmeleridir.

3.       Hücre kültürü : Tek bir hücreden çoğalarak in vitro şartlarda hücrelerin üretilmesidir.

HÜCRE KÜLTÜRÜ TANIMLARI

1.       Primer hücre kültürü : hücrelerin orjin aldıkları doku veya organdan in vitro şartlarda ilk adapte edildikleri formdur.

2.       Permanent  hücre kültürü : sınırsız olarak çoğalabilen ve sub kültürleri yapılabilen hücre kültürleridir. Karyotip özellikleri orjin aldıkları dokudan veya hücrelerden tamamen farklılaşmış hücrelerdir.

3.       Diploid hücre kültürü : karyotip özellikleri orjin aldıkları dokudan belli oranlarda %20-30 farklılık gösterir. Primer kültürlerin sub kültürlerinin yapılması sonucu elde edilir.

4.       Fibroblast hücre kültürü : Embriyonel dokulardan köken alan mekik benzeri morfoloji sergileyen hücrelerdir.

5.       Subkültür : bir kültür ortamında üremesi tamamlanmış olan hücrelerin bir başka kültür ortamına sulandırılarak veya sulandırmaksızın aktarılmalarıdır.

KÜLTÜR ORTAMLARI

1.       Hücre kültürü şişeleri :

-          Cam , plastik , steril , nötr

2.       Hücre üretme vasatları : Steril , besleyici , izotonik, nötr pH , vücut ısısı.

-          Vasat şişe hacminin %10’nu olacak şekilde ortama ilave edilir ve %5-20 oranında değişen miktarda inaktif serum içerir.

KÜLTÜR ORTAMLARI

1.       Vasatın görevi: İçinde barındırdığı hücre için besin kaynağı , hücre fonksiyonları için mineral kaynağı ve uyarıcı , in vivo şartlardaki homeostatik ortamın sağlanması , metabolitler için atık yeri

2.       Serumun görevi : pH regülasyonu yapar. Tutunma ve bağlanma faktörlerini içerir. Hormon ve taşıyıcı maddeleri içerir.

-          Hücreler içinde bulundukları kabın yüzeyi ile olan ilişkilerine göre ;

A – Yerleşik ( tek katlı veya tabakalanmış )

B- Süspanse

-          Hücreler içinde bulundukları kabın hareketli olup olmamasına göre ;

A-     Stationer ( Sabit veya hareketsiz )

B-      Roller ( Döner )

PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ HAZIRLANIŞI

Hücrelerin orjin aldıkları doku veya organların in vitro şartlara ilk adapte edildikleri formdur.  Bu tanımlama ilk subkültürün yapıldığı ana kadar geçerlidir. Genellikle ölümlü ( mortal , finite ) hücrelerdir.

1-ORGAN VEYA DOKU SEÇİMİ:

·         Donörler genç mümkünse fötus olacak

·         Donörler sağlıklı olacak

·         Alınan doku/organ üzerinde bir patoloji olmayacak

·         Alınan doku/organ dondurulmayacak

·         Alınan doku/organ bir kimyasal madde ile temas etmeyecek

·         Soğuk ortamda laboratuvara nakil edilecek

2-LABORATUVAR EKİPMANI

·         UV steril edilmiş çalışma zemini

·         Cam malzeme ( tülbentli beher , petri , erlen , pipet vb.)

·         Operasyon seti ( makas , pens , bistüri , spatula )

·         Manyetik karıştırıcı ve çubuk

·         Maske , eldiven , teint d’ione , pamuk , gazlı bez.

·         Soğutmalı santrifüj

·         37 C’de ayarlı su banyosu ve etüv

·         %0,25 tripsin , PBS , vasat , inaktif dana serum

1.       Doku üzerindeki zar veya kapsula soyulur.

2.       Bir petri kabına makas ile doku parçaları alınır.

3.       Makas ve çift bistüri yöntemi ile iyice küçültülür.

4.       Erlene aktarılan dokular PBS ile tekrarlayan kereler yıkanır.

5.       Isıtılmış tripsin ile hücreler arası bağ doku ayrılır.

6.       Hücre tripsin karışımı her 20 dakikada bir behere alını ve ısısı düşürülür.

7.       Tripsinizasyon dokular iyice parçalanana kadar sürer.

8.       Elde edilen hücre + tripsin karışımı santrifüj ile ayrılır.

9.       Hücreler sayılır , vasat ( dana serumlu ) içinde sulandırılır ve kültür şişesine aktarılır.

10.   37 C’de inkube edilir. Her gün doku kültürü mikroskobunda takip edilir.

TRİPSİN : Bağ dokuları ve proteinleri yıkımlayan enzimdir. Yıkımlama işlemlerinde %0,25’lik tripsin kullanılır.

*Santrifüj normal hücreler zarar görmeden yapılmak isteniyorsa 2000rpm’de en fazla kullanılır bu deviri geçerse hücrelerde patlama gözlemlenir.

Kısaca hazırlama :

·         Doku fiziksel olarak parçalanır.

·         Yıkama temizleme ( PBS ile yıkanır , işlem PBS rengi bozulmayacak duruma gelene kadar devam eder.)

·         Enzimatik parçalama ( Tripsinizasyon ) : 1.tripsinde ortaya çıkan hücreler atık kabına atılır.

·         Enzimin uzaklaştırılması

·         Hücre ortamına geçiş

DOKU KÜLTÜRLERİNİN SAKLANMASI

1.       Kısa süreli saklama : 4-25C arası sıcaklıklarda 4-8 gün arasında kalabilirler. Bu süre içinde mutlaka vasat değişimi yapılmalıdır.

*Vasat normalde kültür ortamlarına %10’nu kadar eklenmektedir. Fakat böyle durumlarda kültür şişesi ağzına kadar vasatla doldurulur.

2.       Uzun süreli saklama : Düşük ısıda idame vasat içinde dondurularak yapılır. Dondurma esnasında hücrelerin zarar görmemeleri için belirli bir oranda gliserin veya Dimethylsülphoxine (DMSO) ilave edilir. Bunun nedeni hücre suyunun kristalleştirme değerini değiştirmektedir. Hücreler süresiz olarak -125C’nin altında saklanırlar.

Marazi Madde : Tanı amacıyla hayvandan alınan herhangi bir maddedir. ( Kan , Doku , Organ vs.)

İnokulum : Hücreye ekmeye hazır hale getirilmiş marazi maddelerinden köken alan maddedir.

VİRUSLARIN EKİMİ

1.       Adsorbsiyonlu : İnokulumu hücre içine ekince yapışmasını 1 saat bekliyoruz.

2.       Adsorbsiyonsuz: bunda ise 1 saat bekleme durumu yoktur. Genelde bilindik virüslerde kullanılan ekim tarzı budur. Ekim sonrası etüve bırakılır.

Başarılar…