VİROLOJİ 1 DERS NOTLARI FİNAL

VİROLOJİ FİNAL

PLAK TİTRASYON

-          Virusların izolasyon ve saflaştırılmasında da kullanılır. Enjekte hücre kültürlerinde virüs çoğalması nedeniyle oluşan etrafı sınırlı boşluklara plak denir.

-          Her virüs plak oluşturması ,  bu özelliği antijenik karakteri ile ilişkilidir.

PLAK OLUŞUMLARINA GÖRE :

a)      Litik ( ortaları boş )

b)      Dejeneratif ( Ortaları dejenere olmuş hücrelerle dolu )

c)       Proliferatif ( ortalarında yoğun hücre proliferasyonu vardır. )

PLAK TEST KRİTERLERİ

1-      Enjekte edilmemiş kontrolde plak oluşmamalıdır.

2-      İnokulüe edilen virüs’un plak meydana getirme özelliği olmalıdır.

3-      Plak sayısı virüs dozu ile paralel olarak artış göstermelidir.

4-      Plak oluşumları spesifik immun serum ile durdurabilmektedir.

5-      Aynı virüs ile yapılan , aynı plak testler aynısı sonucu vermektedir.

PLAK TİTRASYON TESTİ

1-      Virüs log10 tabanına göre sulandırılır.

2-      Hücre sulandırma için petri kutularında üretimi olan hücrelerden 2 adet işaretlenir.

3-      Bu petri kutularında ki hücrelere adsorbsiyonlu yöntemle ekimler yapılır.

4-      İnkubasyon sonrası 2x early – 1,2 -2’lik noble agar karışımı virüs üretme vasatı olarak kullanılır.

5-      CO2’li 37C’lik etüvlere konup plak oluşumları gözlemlenir.

6-      Plakların daha iyi görünmesi için bazen nötral red ile boyama yapılır.

7-      Plak sayıları plak formasyon unit ile hesaplanır.

Sulan dırma	10-1	10-2		10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8
Plak sayısı	Çok	Çok	Çok		Çok	100’den fazla	81	2	0

 PFV : 81/10^-6 hesaplamada 10’nu geçtikten sonraki ilk sulandırma yeri alınır. Ve sulandırma faktörü ile çarpılır.

VİRAL ENFEKSİYONDA TEŞHİS

1-      Direkt yöntemle enjeksiyon teşhisi :

a)      Virüs tespiti :

-          Virüs partiküllerinin tespiti : EM(elektron mikroskobu ) ve HA

-          Serolojik yöntemlerle antijenlerin tespiti

-          Enfeksiyöz virüsün in vivo ve in vitro sistemlerde üretilmesi.

b)      Virüs antijen tespiti :

-          Organ ekstreleri ve doku kesitlerinden immunpresipitasyon , KF , IF , immun enzim reaksiyonları ile antijenlerin tespiti yapılır.

c)       Hemadsorbsiyon

d)      Oligonükleotid dizisinin saptanması

2-      İndirekt yöntemlerle enfeksiyonun tespiti :

a)      Virüs antijeni ( tümör spesifik yüzeysel antijen )

b)      Virüs spesifik antikor ( nötralizan  , presipitan )

c)       enzim

d)      histopatolojik değişiklikler

VİRUS ENFEKSİYONLARINDA TEŞHİS

1-      Direkt teşhis(virüs/antijen tespiti)

a)      Virus üretmeksizin:

-          Morfolojik tanı (EM)

-          Histopatoloji

-          PCR

-          Bilinen immun serum kullanarak Ag tespiti

b)      Virus üreterek:

-          Virusun eldesi

-          Tiplendirme : Fiziksel, kimyasal

-          Biyolojik özellikleri: (HA,H spektrumu)

2-      İndirekt teşhis (antikor tespiti)

-          AGIP

-          KFT       

-          SN(nötralizasyon)

-          NIF , RIA

     VİRÜSLERİN İDENTİFİKASYONUNDA KULLANILAN FİZİKSEL VE KİMYASAL KRİTERLER

1-      Nükleik asit tayini ( DNA-RNA)

2-      Filtrasyon ile yaklaşık virüs büyüklüğünün tespiti.

3-      Isı hassasiyet testi

4-      Tripsin hassasiyet testi

5-      pH hassasiyet testi

6-      çift değerli koyanlarla muamele ( DNA ve RNA üremesine katkı sağlamak için kullanılır.)

7-      Lipit eritici maddelerle muamele

8-      Hemaglutinin tespiti

9-      Elektronikrolobu

VİRÜSLERİN FİLTRASYONU

1-      CPE yapan virüsler kullanılır.

2-      Virüslerin büyüklüğünün tespiti ve bakterilerden ayırt edilmesinde kullanılır.

3-      Değişik büyüklükteki enjektör ve porselen filtreden süzülen virüs doku kültürüne ekilir.

4-      Değerlendirme : CPE ( - ) ise filtreden geçmedi , CPE ( +) ise filtreden geçti. Dolayısıyla büyüklüğü tespit edilmiş olur. Virüslerin ayrımında bakterilerden 220nm , mikroplasmalardan ise 50-100nm por büyüklüğüne sahip filtrelerine sahiptir.

NÖTRALİZASYON TESTİ

Enfeksiyon meydana getirme gücüne sahip olan bir virüs’un , in vivo ve in vitro sistemlerde homoloğu olan antikorlar tarafından enfeksiyözitelerinin bloke edilmesi’dir.

NÖTRALİZASYON TESTİNİN KULLANIM ALANLARI

1-      Tek bir hayvandan veya sürüden alınan kan örneklerinde antikorların tespitinde ;

a)      Epidemiyolojik kontrollerde ( hayvan popülasyonunda ki antikorların prevalans’ı ve dağılımını belirler.)

b)      Çift serum numunesinden enfeksiyonun tespiti amacıyla.

c)       Serolojik seleksiyon amacıyla.

d)      Aşı antijeninin tespit edilmesi amacıyla

e)      Aşılama sonrası antikor düzeyinin saptanması

f)       Karantina merkezlerinde araştırma için.

2-      Araştırılan materyalindeki virüs izolatının serolojik olarak tiplendirilmesi ve identifikasyonu.

*NÖTRALİZASYON TEMEL BASAMAKLARI

1-      Serum sulandırma

2-      100 DKID50 virüs ekle

3-      İnkübasyon

4-      Hücre ekleme

5-      2.inkübasyon

6-      Pleyt okuma

Pozitif serum : tek bir hastalık için uygun antikor yönünden pozitif olması.

Negatif serum : Tek bir hastalık için uygun antikor yönünden negatif olması.

Hiperimmun serum :

Tip spesifik serum : etken virüs’un serotiplere karşı spesifik antikor yönünden pozitif olması.

Not : 100 DKID50 kullanılmasının nedeni virüs girdiği her yerde CPE oluşturmasını istediğimiz için.

NÖTRALİZASYON SULANDIRMA

1-      Log2 tabanında sulandırma yapılıyor.

2-      Serum sulandırmak için kullanılır.

Testin yapılışı : 6 adet tüp alıyoruz ve bu tüplerin 1. Tüpümüz serum bulunuyor bundan alınan 1 ml içerik diğer 2.tüpe aktarılıyor ondan alınan ise 3 e 4-5-6 diye devam ediyor ve sulandırma işlemimiz tamamlanıyor

1.       Tüp : serum

2.       Tüp : ½ oranında sulandırma

3.       Tüp : ¼ oranında

4.       Tüp : 1/8 oranında

5.       Tüp : 1/16 oranında

6.       Tüp : 1/32 oranında sulandırma yapılıyor.

İlk önce gözlere sulandırdığımız serum konulur. Daha sonra eşit hacimli virüs ve serum bir araya getirilerek nötralizasyon gerçekleşmesi beklenir. ( 0,05ml virüs + 0,05ml serum ) ( 37 C’de 1 saat inkübasyon yapılır.)  daha sonra pleytlerdeki CPE’lerine bakarak okuma yapıyoruz. SN50 değeri oluşan CPE yarısı olduğu zaman alarak kabul ediyoruz.

SERUM SULANDIRMA	CPE	NÖTRALİZASYON
½	0/4	+
¼	0/4	+
1/8	0/4	+
1/16	0/4	+
1/32	2/4	+ ( SN50) DEĞERİ
1/64	4/4	-
HK	0/4	0,1 serumlu HÜV
VK	4/4	0,05 ml virüs + 0,05 PBS

Komplement : antikor- antijen kompleksine bağlanan protein yapılı stoliz yapan bir oluşumdur. Isıya çok duyarlıdır.

Konjugat : işaretli bir antikordur ( IF , IP , ELİSA ) testlerinde kullanılır. Ortamda CPE oluşturmayan virüslerin olup olmadığını kontröl etmek için kullanılır.

Amboseptör : bir hemolitik sisteme özgü olan eritrosite spesifik antikorlara verilen isimdir.

Stebilize eritrosit : Bazı kimyasallarla muamale edilen eritrosite antijen ( virüs ) girer ve içinde kalır. Bu tarz eritrositlere denir.

HEMAGLUTİNASYON TESTİ

-          Bazı virüslerin insan yada hayvan eritrositleri ile karşılaştıklarında süspansiyon halinde bulunan bu eritrositlerin bir birine yapıştırarak onların çökertmesi olayıdır. ( bu antijen – antikor reaksiyonu değildir. )

-          Bazı virüslerde bulunan hemaglutininlerin eritrositlerdeki reseptörlere yapışması ve onları çöktürmesi prensibine dayanır.

1.       Tip HA : hemaglutinin eritrosit ile birleştikten sonra tekrar ayrılabiliyor

2.       Tip HA : Hemaglutinin virüs zarına sağlam bağlı olmadığından eritrosit ile birleşip ayrıldıktan sonra bir daha hemaglutinasyon yapamaz.

3.       Tip HA :  geri dönüşümsüzdür.

-          HA iki şekilde yapılır ;

1-      Çabuk HA ( Kalitatif )

2-      Yavaş HA ( Kantitatif )

-          HA’da sulandırma Log2 tabanında yapılır.

-          HA’da birim olarak HB ( Hemaglutinin birimi kullanılır. )

HA testinde kullanılcak eritrosit süspansiyonunun hazırlanması :

1-      EDTA’lı tüpe kan alınır.

2-      Santrifüj 2000rpm ‘de 5 dk , en alt kısıma çöken eritrositler alınır.

3-      %0,85 FTS ile bu eritrositler 3 kez yıkanır , santrifüj 2000rpm de 5 dk.

4-      Son yıkamadan sonra dipteki çöküntü %100 eritrosit kabul edilir.( +4 C ‘de 8 gün saklanabilir. ) ve kullanılacağı zaman PBS ve FTS ile %0,5 sulandırılarak kullanılır.

NOT : Yer çekimi etkisiyle eritrositler çöktüğü zaman düğme şeklinde olur hemaglutinasyon var demektir.

ÇABUK HA TESTİNİN UYGULANMASI

1-      Testi yapmak için hazırlanmış eritrosit süspansiyonu , şüpheli virüs materyali.

2-      Yaparken şüpheli virüs materyalinden 1 damla ( amaç eşit miktar) lam üzerine konur. Sonra eritrosit süspansiyonundan 1 damla konur. Daha sonra bunlar karıştırılır.

3-      Karıştırdıktan sonra eğer eritrosit çökerse (aglutine eder ) etken var kabul edilir.

YAVAŞ HA TESTİ UYGULAMASI

1-      Teste başlamadan önce etkenin aglütinasyon (çöktürme) özelliği olup olmadığına bakılır.

2-      Eğer aglütinasyon özelliği var ise Log2 tabanında sulandırma yapılır.

3-      Tüplerde yada tablet gözlerinde virüs sulandırmaları ile eritrosit eşit hacimde birleştirilir.

4-      Uygun ısıda inkübasyona bırakılır. (CO’da  +4 C’de veya 37 C )

5-      Sonuç tüplerin yada tablet gözlerinin dibindeki görüntüye göre değerlendirilir.

6-      Tüpteki gözlerde eritrositlerdeki virüs tarafından değilde yer çekimi ile çöktüğü sulandırma basamağından önceki basamak yani etrafında aglütinasyon görmüdüğümüz son basamak bizim için HB olarak kabul edilir.

HEMAGLUTİNASYON İNHİBİSYON TESTİ ( HI )

Virüs’un HA yeteneğinin spesifik serum ile ortadan kaldırılması prensibine dayanır.

2 şekilde yapılır ;

a)      Serum sulandırma metodu ( Log2 )

b)      Virüs sulandırma metodu ( Log2)

-          HA ölçülmüş , titresi belli ise etken vardır.

-          HI titresi hesaplanırken 4 HB kullanılır. CBU birim ortamda ne kadar eritrosit varsa hepsini çökeltebilir , yani 100DKID₅₀ ile aynı mantıktır.

Not : temel mantık nötralizasyon ile aynıdır.

Yapılışı

-          3 adet bileşen vardır ; şüpheli serum ( etken virüsa karşı antikor şüpheli ) , titresi hesaplanmış virüs ve eritrosit süspansiyonu.

-          Şüpheli serum 6 basamak ( Log2 tabanında ) sulandırılır. Daha sonra sulandırılan gözlere titresi bilinen virüs eşit hacimlerde aktarılır.

-          İnkübasyona bırakılır ( 1 saat 37 C’de )

-          Sonra üzerine eritrosit süspansiyonu eklenir. Eğer serum içinde virüsa karşı antikor var ise eritrositlerin hemaglutinasyon olmadan doğal şekilde çöktürülür.

-          Sulandırma basamakları ilerledikçe serumda ki antikor miktarı azalır.

-          Öyle bir basamak gelecek ve virüs eritrositleri hemaglutine edecektir.  İşte bu inhibisyonu ( yani HI’unu ) gördüğümüz son basamak HIB ( Hemaglutinasyon inhibisyon birimi ) adını alır.

AGAR SEL PRESİPİKASYON TESTİ ( AGPT )

Agar içerisinde antikor ile antijenin birbirine doğru sızarak optimal miktarlarının karşılaştığı noktalarda bir çöküntü meydana gelmesi esasına dayanır.

Presipitojen : antijene verilen isim.

Presipitin : antikora verilen isimdir.

Presipitat : çöküntüye ( antikor + antijen birleşmesi ) verilen isimdir.

-          Test’de pH 7,0 -8,0 olan %1’lik noble agar veya agaroz kullanılır.

-          2 bileşiğe ihtiyaç vardır ; noble agar veya agaroz teste özel delici.

Uygulanışı

-          Agar otoklav edildikten sonra petri kutularına aktarılır ve ağarın donması için beklenir.

-          Özel delici kullanarak , merkezde bir ve bunun çevresinde merkeze eşit uzaklıkta 6 göz açılır.

-          Amaca göre bilinen materyal merkeze , şüpheli materyaller periferdeki gözlere ilave edilir ve 48 – 72 saat nemli ortamda inkübasyonu takiben ışık kaynağı karşısında sonuçlar değerlendirilir.

-          Temel mantık antijen ve antikorun yarı katı ortamda difüzyon yaparak birleşirlerse ortaya gelen antikor antijen kompleksini ışık altında gözle görülmesi.

-          Bilinen ve şüpheli materyalin yerleştiği gözler arasında presipitat oluşumu(+) ( bant şekli oluşur) reaksiyon olarak değerlendirilir. ( eğer antikor antijene göre fazla ise merkeze yakın presipitat oluşur. Kan antijen fazla ise dış kuyucuklara yakın yerde presipitat oluşur.)

KOMPLEMENT FİKSASYON TESTİ ( KFT )

2 sistem ortak olarak çalışır ;

-          Hemolitik sistem ( görüntülüme sistemi) :

a)      Amboseptör ( anti koyun  eritrositleri serumu )

b)      Yıkanmış koyun eritrositleri

-          Antijen – antikor sistemi(sorgulama testi) :

a)      Antijen ( bilinen veya şüpheli )

b)      Antikor ( bilinen veya şüpheli )

c)       Komplement

Komplementi tespit eden antikorlar spesif virüsla bağlanarak komplementi sarf ederler.  Eğer komplement sarf edilmez ise amboseptör , komplement vasıtasıyla eritrositlerde hemoliz oluşturur. Testin temelinde bu reaksiyon tespiti vardır. Yani şüpheli bir serumumuz , bilinen virüsümüz ve birde komplement vardır. Bunları eşit hacimde bir araya getirirsek eğer şüpheli serum içinde bilinen virüsa karşı spesifik antikor ( homolog ) var ise bir antijen- antikor kompleksi oluşur. Bunu gören komplement’de bu komplekse bağlanır ve ortamdaki komplement tüketilir. Eğer görüntüleme sistemi olan hemolitik sistem bunların üzerine ilave edilirse ortamda komplement olmadığı için hemoliz gözlenmez. Tam tersinde yani şüpheli serumda bilinen virüsa karşı spesifik antikor yok ise kompleks oluşumayacağı için ortamda komplement harcanmaz. Hemolitik sistem konuluncada hemoliz oluşur.

PLAK REDÜKSİYON TESTİ

-          Plak oluşturan virüsların bu özelliklerinden faydalanarak interferon , antikor ve virüsların saptanması temeline dayanır.

-          İnterferon tespitinde : hücreler önce interferonla karşılaştırılır , daha sonra plak oluşturma yeteneğine sahip bilinen virüsla muamale edilerek plak oluşup oluşmadığı kontrol edilir.

-          Antikor tespitinde : şüpheli serum önce plak oluşturma yeteneğine sahip bilinen virüsla muamele edilerek bu karışım hücre hültürüne eklenir ve plak oluşup oluşmadığı kontrol edilir.

-          Virüs tespitinde : petri kutusundaki hücreler önce immun serum ile daha sonra şüpheli virüs ile muamele edilerek virüs varlığı tespit edilir.

-          Sulandırma Log10 tabanında yapılır.

Sulandırmalar	VK	İnterferon
10-1	125 plak	50 plak
10-2	75 plak	25 plak
10-3	30 plak	10 plak
10-4	10 plak	Plak yok
10-5	5 plak	Plak yok

-          İnterferon ile muamele edilen hücrelerdeki plak sayısı interferon ile muamele edilmeyen hücrelerdeki plak sayısından daha az ise test (+). Yani interferon çalışarak plak oluşumunu engellemiştir.

İMMUN PLAK TESTİ

Plak test ve immun peroksidaz testinin kombinasyonu ile geliştirilmiş ,  hücre kültüründe yapılan bir testtir. Özellikle BVD virüs’unun cpe ve ncpe tiplerinin tespitinde kullanılır.

-          Plak oluşumları farklıdır. Nonstopatolojik etki gösterenlerde plakta orta kısımında hücreler tamamıyla görünürken stopatolojik etki gösteren plaklarda orta kısımda boşluk etrafında çember görünür.

SİNGLE RADİAL HEMOLİSİS TESTİ

Testin prensibi : agaroz ile oluşturulan yarı katı ortam içinde antijen ile duyarlaştırılmış eritrositlerle antikorun birleşmesi ve komplementtin bu komplekse bağlanması sonucu hemoliz halkalarının görülmesi esasına dayanır.

Sensibilize eritrosit : bir takım kimyasal maddeler ( kromklorür ( CrCl₂) , potasyumperiodat ( KIO₂) ) aracılığı ile antijen ve eritrositlerin birleştirilip antijen özelliğinin eritrositlere geçirilmesi esasına dayanarak elde edilir. Bu sensibilize eritrositler hem antijen karakteri taşırlar hem de kan hücresi olması özelliğini korurlar. Bu testte virüs kullanılmaz , onun yerine antijen olarak sensibilize eritrositler kullanılır.

Yapılışı :

-          Su banyosu 45 C ‘ye ayarlanır.

-          2,8 ml agaroz 100 C’de eritilip 10 dk 45 C’deki su banyosuna konulur.

-          0,1 ml komplement 45 C su banyosuna konulur.

-          Sensinbilize eritrositlerde bu ortama eklenir.

-          Bu 3 madde karıştırılıp petri kutusuna dökülür ve +4 C ‘de 1 gece bekleterek donması sağlanır.

-          Ertesi gün agar üzerine delikler açılarak bunlara emici kağıtlar yerleştirilir.

-          Bu deliklere şüpheli serum , - kontrol , + kontrol serumlar damlatılır.

-          +4 C’de 16-17 saat bekletilir. ( bu süre içinde serumlar agar içinde yayılır.)

-          Süre sonunda buzdolabından çıkarılan petriler 37 C’de 3 saat bekletilir.  Bu süre içinde eğer homolog iseler – antikor ile sensibilize eritrositler komplement eşliğinde birleşecekler ve hemoliz şekillenecektir.

HEMADSORBSİYON TESTİ

-          Virüsla enfekte hücre kültürlerinde eritrositlerin adsorbsiyonudur.

-          Eritrositler virüs spesifik hemaglutinin reseptörlerine adsorbe olurlar. Hemaglutinasyon yeteneğine sahip virüslarla enfekte edilmiş doku kültürlerine %0,5’lik eritrosit ilave edildiği zaman hemadsorbsiyon oluşur.

-          Çoğunlukla CPE yapmayan virüsların tespitinde kullanılır.

-          Değerlendirmede : şüpheli marazi maddede CPE oluşturan veya oluşturmayan bir virüs varsa bulunduğu yerlerde eritrositler kümelenecektir. Yani kümeleşmede test ( +) ‘dir.

FLORESAN ANTİKOR TESTİ

-          Florasan bileşikleri ile işaretli antikor yada anti-antikor ( konjugat ) kullanılarak , şüpheli materyaldeki antijen yada antikorların tespitini sağlayan , direkt teşhisi çok çabuk sonuç veren bir yöntemdir. 3 şekilde yapılır ;

a)      Direkt immun floresan testi ( antijene ( virüs’a ) yönelik bir tarama yapılır. )

b)      İndirekt immun floresan testi ( burda ise antikora yönelik bir tarama yapılır. )

c)       Nötralizasyon immun floresan testi ( serumdaki antikor varlığını sorgular.)

Not : organizmaya bir antijen verildiğinde bu antijene karşı bir antikor sentezlenir. Bu antikor primer antikor denir. Eğer bu antikor işaretlenirse etkene karşı tarama yapılabilir. Ama eğer serolojik bir tarama yapılacaksa antikora karşı antikor sentezletilir. Sentezletilen antikora anti-antikor denir. ( sekunder antikor ).

Konjugat hazırlanması :

-          Teşhisi yapılacak virüslere karşı deneme hayvanlarından hiperimmun serumlar elde edilir.

-          Bu serumlar safodex kalanlarından süzülerek IgG ‘leri ayrılır.

-          Bu IgG’ler floresein isotieosyonat ( FITS)  ile muamele edilip boyanır.

-          Nonspesifik boyamaları önlemek için tekrar süzülür.

-          Konjugatın titresi belirlenir.

Direkt immun floresan testi

-          Kullanılcak olan konjugata floresein isotieosyonat ile işaretli virüs’a spesifik antikorlardır.

1-      Şüpheli virüs Dk ekilir.

2-      37 C’de 48 saat virüs’un üremesi beklenir.

3-      Hücrelerin yüzeyine konjugat eklenerek 37 C’de 1 saat nemli ortamda beklenir.

4-      Floresan mikroskopta sonuçlar değerlendirilir.

Değerlendirme : virüs var ise ( kendi proteinlerini hücre zarında sentezletir. Antikorda gidip buralara bağlanır ve burada kalır. ) konjugatla birleşir ve enfekte hücrelerde yeşil floresan ışıldama meydana gelir. Yeşil ışıldama var ise test ( +) ‘tir.

İndirekt immun floresan testi :

-          Kullanılan konjugat bir canlı türüne ait antikorlara karşı hazırlanan anti-globilinlerin floresan birleşikleri ile bağlanması ile hazırlanır.

1-      Bilinen virüs Dk ekilir.

2-      37 C’de 48 Saat virüs üremesi beklenir.

3-      Süre sonunda hücre yüzeyleri PBS ile yıkanır ve şüpheli serum ilave edilir.

4-      37 C’de 1 saat beklenir ve PBS ile yıkanır.

5-      Konjugat eklenerek 37 C’de 1 saat nemli ortamda beklenir. ( kullanılan konjugat şüpheli serumun alındığı hayvan türünün IgG’lerine karşı elde edilmiş IgG’lerin floresan boyalarla işaretlenmiş şeklidir.)

6-      Süre sonunda floresan mikroskopta değerlendirme yapılır.

Değerlendirme : Konjugat antikora karşı hazırlanmış olduğundan , antikor ile antijen birleşmişse konjugatta bunlarla birleşmeyeceğinden yeşil ışıldama meydana gelecektir. Yani yeşil ışıldama + ise IF + ‘dır.

NÖTRALİZASYON İMMUN FLORESAN TESTİ

-          100 DKID₅₀’si bilinen virüs ile şüpheli serum bir tüp içerisinde eşit oranda karıştılır.

-          Nötralizasyon olması için 37 C’de 1 saat inkübasyona bırakılır.

-          Süre sonunda bu karışımlar lamellerde üretilmiş DK ekim yapılır.

-          37 C’de 48 saat bekletildikten sonra lameller 10 dk aseton ile fikse edilip her lamele birkaç damla konjugat ( bilinen virüs’a karşı hazırlanmış  işaretli antikor ) konulur.

-          37 C’de 1 saat inkübasyona bırakılır.

-          Floresan mikroskopta sonuçlar değerlendirilir.

Değerlendirme : bilinen virüsla şüpheli serum birleşirse konjugat virüsa bağlanamayacağından yeşil ışıldama oluşmaz dolayısıyla yeşil ışıldama görülmüyorsa NIF testi (+) ‘dır. Buda bize şüpheli serumun bilinen seruma karşı antikor taşıdığını gösterir.

IMMUNPEROKSİDAZ TEKNİĞİ

-          Antijen ve antikorların peroksidaz enzimi kullanarak görülebilir hale getirilmesi esasına dayanır.

Testin temel prensibi : öncellikle serolojik bir reaksiyonun oluşmasıdır. Substrat hücre yüzeyine verildğinde burada bulunan peroksidaza bağlı antijen antikor kompleksi ile aralarında bağlanma olarak subsrat’ın oksidasyonu meydana gelmektedir. Bu oluşumda rengin sarıdan kahverengiye dönüşümü ile kendini belli eder.

Tanım : enzim ile işaretli antikorlar ve substrat kullanarak , şüpheli materyalde bulunan etken ( yada Ag ) yada bunlara karşı oluşmuş antikor varlığının araştırıldığı immunostokimyasal bir yöntemdir.

·         Kullanım amaçları **:

-          Marazi madde inokule edilen hücrelerde antijen tespiti.

-          Doğal enfekte hücrelerde antijen tespiti

-          Antikor tespiti

İmmunperoksidaz testi için gerekenler : H. Kültürü , konjugat , substrat , virüs , serum , invert mikroskop test , tablet ve solüsyonları.

Konjugat : enzim ile işaretli antikor. İşaretleyici madde olarak peroksidaz ( ençok ) glucosoxidaese , B-galaktosidoz kullanılır.

Substrat : enzimi ile reaksiyona girerek immun kompleksin varlığını ortaya koyan maddedir. Enzim-substrat ilişkisi sonucunda viral antijenin bulunduğu bölgelerde boyanma oluşur.

·         Genel mantık immunfloresan testi ile aynı , bunda sadece işaretleme enzim ile yapılır olmasıdır.

TEST YÖNTEMLERİ

1-      Direkt immun peroksidaz testi ( Antijen tespiti için)

2-      İndirekt immun peroksidaz testi ( antijen yada antikor tesbiti için )

3-      Nötralizasyon peroksidaz testi ( antikor tespiti için )

DİREKT İMMUN PEROKSİDAZ TESTİ

1-      Dk’leri hücre kültürü pleytlerinde üretilir.

2-      Şüpheli materyallerin her birisi için bir göze adsorbsiyona bağlı yöntemlerle ekim yapılır.

3-      37 C’de 1 saat inkübasyona bırakılır ve daha sonra yıkama yapılır.

4-      Peroksidaz enzim ile işaretlenmiş spesifik antikorlar ( konjugat ) ilave edilir. ( 1 saat 37C’de inkübasyon)

5-      Yıkama işlemi yapılır.

6-      Substrat ilave edilir.

7-      Renk değişikliğine göre değerlendirme yapılır.

Değerlendirme : Hücre içinin kahverengi renk oluşumu (+) gösterilir.

ELISA TESTİ

-          Direkt ve indirekt teşhis amacıyla kullanılır.

-          Testin prensibi : şüpheli antijen veya antikorların homoloğu olan ve enzimle işaretlenmiş bir konjugata bağlanması ve bu bağlantının substrat ile renk oluşturarak gözükür hale gelmesi esasına dayanır.

-          Hücre kültürü kullanılmasına gerek yoktur.

DİREKT ELİSA TESTİ ( ANTİJEN VARLIĞI ARANIR)

1-      Elisa pleytleri Coating buffer yardımıyla yardımıyla bilinen antikor ile kaplanır. ( yani aradığım antijene spesifik antikor )

2-      Antikor kaplı bu gözlere şüpheli virüs konularak 37C’de 1saat inkübasyon ve yıkama uygulanır.

3-      Süre sonunda gözlere konjugat ilave edilir. Tekrar 37 C’de 1 saat inkübasyon ve yıkama uygulanır.

4-      Konjugat ; aranan antijen homoloğu olan enzimle işaretli antikor.

5-      Sonuçların okunabilmesi için bütün gözlere substrat ilave edilir.

6-      Belli bir müddet sonra reaksiyon durdurulur.

7-      Renk değişiklikleri gözle veya spektrofotometreik saptanıp değerlendirilir.

Değerlendirme : şüpheli marazi maddede virüs varsa konjugat ve substrat  ile birleşerek ve renkli ürünler meydana getirecektir. Yani renk (+) ise virüs vardır.

Not : elektroforez testi PCR’ın devamı olarakta kullanılabilir.

ELEKTROFOREZ TESTİ

-          Elektiriksel bir alanın tesiri altında kolloid dispers fazlarının taşıdıkları elektiriksel yükün aksi kutuba doğru göç etmeleri olarak tanımlanır.

-          Moleküllerin bulunduğu ortama elektrik alanı uygulaması moleküller üzerinde elektrik alanı gücü ve miktarına uygun bir kuvvet oluşturur. İşte bu kuvvet moleküllerin taşınmasına ve kısa bir sürede belli hizalaşmalarına sebep olur. Bu ortak ilerletici güç ile taşınan partiküller , sürtünmeye bağlı direnç dengelendiği anda sabitleşme meydana gelir ve protein bantları oluşur.

Elektroforez tankı : katodal ve anodal olmak üzere iki bölüm içerir.

Güç kaynağı : Elektriksel gücü üretir.

Tampon solüsyonları : elektrik akımını iletmek ve pH değişikliklerini tamponlamak.

Elektroforez pleytleri : zeminde kullanılan film tabakaları veya cam pleytler

Destek matrix : agaroz jel , kollogen veya poliakrilamidfaj

Boyalar : Preparatların gözle görülmesi için kullanılır.

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU

Tanım : test hedef DNA ya da RNA dizilerinin in vitro olarak çoğaltılması ve daha sonra NA varlığının saptanmasıdır.

PCR aşamaları

1-      Amplifikasyon : hedef NA’nın çoğaltılmasıdır.

2-      Nükleik asit tespiti – elektroforez

Not : PCR’da çoğaltmak için seçeceğimiz nükleik asit parçasını seçerken çalışmak istediğimiz virüsa spesifik olmalıdır.

Amplifikasyon aşamaları

a)      Denaturasyon (95C) : Çift iplikçikleri DNA tek iplikciğe ayrılır. Yani denatüre edilir.

b)      Hibridizasyon (50C) : denatüre olmuş dna tek iplikciklerinin uçlarına sentetik oligonükleotidler primerler bağlanır.

c)       Polimerizasyon (60C) : taq polimeraz etkisiyle 3 ucundan bağlanan primer basamak ve tek iplikcik kalıp olarak kullanırak , çift iplikcik DNA oluşur.

PCR AVANTAJLARI :

1-      Kısa sürelerde sonuca ulaşılır.

2-      Çok az miktardaki DNA ve RNA partikülü çoğaltılıp görmeyi sağlayabilir.

DEZAVANTAJLARI

1-      Materyaldeki az miktardaki NA saptanabilir hale getirildiğinden duyarlılığı yüksektir.

2-      Ortama giren tek bir kontaminat DNA (hedef DNA ile aynı sekansa sahip ) aynı ölçüde çoğalarak , yanlış pozitif sonuca neden olabilir.

3-      Pahalıdır.

İMMUN SİSTEM HÜCRELERİ

1-      B lenfositleri

2-      T lenfositleri : yardımcı ve sitotoksik

3-      Monositler ( makrofajlar vs.)

4-      Doğal katil hücreler ( NK)

VİRAL ENFEKSİYONLARDA İMMUN YANIT

1-      Virüs partiküllerinin organizmaya girmesi ve enfeksiyonun başlamasını takiben ilk savunma reaksiyonunu gösteren hücreler makrofajlardır.

2-      Makrofajlar virüsü hedef dokulara ulaşmadan elimine etmeye çalışır. Ayrıca fagosite ettiği virüsü parçalayarak T hücrelerine antijen sunma işlemi yapar.

3-      Yardımcı t lenfositlerde bulunan CD4 molekülü makrofajların yüzeyinde bulunan NHC-2 cervical antijen kompleksine bağlanır. Th1 lenfositler çoğalarak lenfokinleri salınımına başlar.

4-      Th1 lenfositlerden interleukin-2 ( IL-2) , IL-3 ve gama interferon lenfokinleri salınır. Bunların etkisiyle monositler enfeksiyon bölgesine göç eder ve makrofajlara dönüşürler.

5-      Aktive olan makrofajlar kemotaksis , fagositik özellik ve antijen parçalama yeteneği gösterirler.

6-      Th2 lenfositlerinden (IL-4 , IL-5 VE IL-6 ) lenfokinleri salınır. Bunların etkisiyle B lenfositler çoğalarak antikor sentezleyen plazma hücrelerine dönüşür.

7-      Humoral yanıtın ilk evrelerinde oluşan plazma hücreleri kısa ömürlüdür ve IgM sınıfı antikor sentezler.

8-      Daha sonraki uzun ömürlü plazma hücreleri ( IgG sentezler ) ve bellek hücreleri şekillenir.

9-      Serumdaki antikor titresi enfeksiyonu takiben 2-3. Haftalarda en yüksek düzeyde iken 4-6 hafta sonra düşmeye başlar.

ENFEKSİYONU TAKİBEN ORGANİZMADA ŞEKİLLENEN İMMUNOLOJİK  YANIT SÜRESİ

1-      İlk 24 saat : makrofajlar aktivitesi : fagositoz ve T hücrelerine antijen sunma

2-      1-2.gün : doğal katil hücreleri ( NK) fagositik aktivite

3-      2-5.gün : İnterferon

4-      7.gün : Yardımcı ve sitotoksik T lenfosit etkinliği B hücrelerinin aktivasyonu ile antikor üretiminin başlaması ve enfekte hücrelerin elimine edilmesi

5-      2-3.hafta : Antikor üretimi ve T hücre yanıtının ortamdan kalkması.

VİRÜS ENFEKTE HÜCRELERİN ELİMİNASYONU

1-      DOĞAL KATİL HÜCRELERDE LİZİS : konak hücrede üremesi sonucu MHC-1 protein sentezi yıkımlanır ve buna bağlı olarak NK hücreleri virüsla enfekte hücreyi tanıyıp yıkımlar.

2-      SİTOTOKSİK T LENFOSİTLERDE LİZİS : sitotoksik t lenfositleri üzerinde bulunan CD8 molekülü makrofajların yüzeyinde bulunan MHC-1 ve viral antijen kompleksine bağlanır. Sitotoksik t hücresinin sitoplazmasında bulunan granüllerden salınan perforin , enfekte hücrelerin plazma membranında por oluşturur ve hücre lizisini başlatır. Ayrıca sitotoksik t lenfositi ve doğal katil gücreleri esteraz salarak enfekte hücrelerin apoptozie uğramasını sağlar.

3-      ANTİKOR BAĞIMLI – HÜCRE  ARACIKLIKLI LİZİS : genellikle IgG sınıfı antikorlar hedef hücre yüzeyindeki viral antijenlere bağlanarak hücre yüzeyini kaplarlar. Sitotoksik t lenfositleri ve NK hücreleri fc reseptörleri ile bu bu antikorlara bağlanarak enfekte hücreyi lize ederler.

4-      KOMPLEMENT ARACILIKLI LİZİS : zarlı virüslarda membrana tek kompleksli lipid bilayer hücre membranına sokularak perforinde olduğu gibi membran üzerinde por açılmasına ve hücrelerin lizisine yol açar.

MATERYAL İMMUNİTE

1-      YAPAY PASİF İMMUNİTE : başka bir bireyden alınan veya deneysel koşullarda üretilen antikorların lokal veya parenterol olarak uygulanmasıdır.

2-      DOĞAL PASİF İMMUNİTE :

1-      Kanatlılarda yumurta sarısıyla memelilerde ise plasental veya kolostral yolla antikorların aktarılmasıdır.

2-      Çiftlik hayvanlarında ( sığır , koyun , at , keçi ) sadece kolostral yolla materyal bağışıklılık sağlanır. Çünkü bunların plasentasından antikorlar geçemez.

3-      Kedi ve köpeklerde düşük düzeyde plasenta ile IgG aktarılır.

MONOKLONAL ANTİKORLAR ( MKA) : bir immunojen’in antijenik determinatları tarafından uyarılmış her bir B hücresi , vücuttan ayrılarak üretilirse , bir hücreden köken alan hücre topluluğu tarafından oluşturulan antikorlara denir.

C reseptörüne bağlanan : IgG ( c)

D reseptörüne bağlanan IgG ( d)

NOT : yani her bir antijenin determinantına ait olan antikorlar vardır.

MKA KULLANIM AMAÇLARI

Teşhis : Elisa ( P ve IF için konjugat hazırlanmasında , izolatların tip-alttip ayırımında

Seroprofileksi : pasif bağışıklılık temini

Sağaltım : akut hastalık ve kanser tedavisinde

Aşı için immunojen seçiminde kullanılırlar.

POLİKLONAL ANTİKORLAR

-          Bir etkenin farklı epitopları tarafından uyarılan ayrı ayrı B lenfositlerin farklılaşarak plazma hücrelerine dönüşmesi sonucunda farklılaşan hücrelerin uyarıldığı epitoplara spesifik olarak salgıladığı antikorların bütünüdür.

Buradaki bütün reseptörelere bağlanabilen yani IgG ( a+b+c+d ).  Yani bütün determinantları içeren antikor.

Harun Kaya – Recep Özkaya – Onur Çakmak.

-          Mustafa Has’a teşekkürler J